摘要：18世纪工业革命以来,石油资源的大量消耗导致大气CO2含量的迅速升高。而CO2含量的升高促成了全球气候变暖。利用可再生资源生产聚合物成为解决这一不足的策略之一。每年全世界大约生产1,200,000吨聚酰胺,其中尼龙-6和尼龙-66约占90%。如果我们能用可再生资源来生产聚酰胺,这将能有效遏制全球气候变暖。尼龙66是由己二胺和己二酸1：1聚合生成。尸胺(1,5-戊二胺)是赖氨酸脱羧的产物,它的结构与己二胺非常相似,可以替代由石油制备的己二胺,已有技术可以将尸胺精炼后和己二酸工具合成具有实用性的尼龙-56,尼龙-56是一种耐高温的新型塑料。为使谷氨酸棒杆菌能生产尸胺,必须要在谷氨酸棒杆菌细胞内表达外源赖氨酸脱羧酶基因。本探讨在前期工作的基础上,以蜂房哈夫尼菌Hafnia alveiAS1.1009基因组为模板,通过PCR扩增,得到大小约为2.2kb的赖氨酸脱羧酶基因ldc。以大肠杆茵/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19为载体,将扩增得到的目的基因片段克隆至C. glutamicum TK260512,获得重组菌株C. glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc。重组菌株经IPTG在30℃诱导后,SDS-PAGE结果显示赖氨酸脱羧酶基因得到了表达,它编码的蛋白质分子量为83kD。利用250mL三角瓶发酵,对重组菌株C. glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc的尸胺发酵条件进行了优化,确定了进行摇瓶发酵的合成培养基配方及培养条件。(1)培养基：葡萄糖11%、(NH4)2SO44%,豆饼水解液5%,CH3COOH0.6%, K2HPO42.5g/L, MgSO4·7H2O0.75g/L, CaCl2·2H2O50mg/L, FeSO4·7H2O50mg/L, MnSO4·5H2O13mg/L,烟酸14mg/L,硫胺素盐酸盐7mg/l,生物素0.5mg/l,磷酸吡哆醛0.5mg/L (pH7.0)。(2)接种量：8%(3)装液量：30ml/250mL三角瓶(4)震荡频率：200r/min重组菌株C. glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc在上面陈述的培养基和培养条件下经36h发酵,尸胺最终产量达到2.52g/L,比优化前提升了83%。关键词：赖氨酸脱羧酶论文谷氨酸棒杆菌论文尸胺论文
本论文由www.808so.com摘要4-5
ABSTRACT5-9
1 前言9-21
1.1 尸胺介绍9-14
1.1.1 尸胺的性质9
1.1.2 尸胺的生物学作用9-11
1.1.3 新型耐高温塑料尼龙-5611-12
1.1.4 尸胺的生产策略12-14
1.2 L-赖氨酸脱羧酶14-16
1.2.1 L-赖氨酸脱羧酶性质和来源14-15
1.2.2 L-赖氨酸脱羧酶酶活测定策略15-16
1.3 谷氨酸棒杆菌表达系统16-19
1.3.1 棒杆菌载系统统的探讨16-18
1.3.2 转化技术18-19
1.4 论文立题背景及主要内容19-21
1.4.1 立题背景19-20
1.4.2 本课题探讨内容20-21
2 材料与策略21-36
2.1 实验材料21-24
2.1.1 菌株与质粒21
2.1.2 试剂21-22
2.1.3 溶液22-23
2.1.4 培养基和抗生素23-24
2.1.5 仪器24
2.2 实验策略24-36
2.2.1 Hafnia alvei染色体的提取24-25
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳25
2.2.3 基因克隆25-27
2.2.4 克隆载体的构建与鉴定27-29
2.2.5 表达载体的构建与鉴定29-30
2.2.6 谷氨酸棒杆菌转化实验30-32
2.2.7 浅析测定策略32-34
2.2.8 酶活浅析34-36
3 结果与讨论36-59
3.1 基因克隆36-41
3.1.1 Hafnia alvei AS1.1009染色体DNA的提取36
3.1.2 PCR扩增目的基因36-37
3.1.3 克隆载体的构建与鉴定37
3.1.4 酶切验证37-39
3.1.5 赖氨酸脱羧酶基因序列浅析39-41
3.2 重组质粒pXMJ19-1dc的构建及鉴定41-43
3.3 重组质粒电转化C.glutamicum43-45
3.3.1 培养基对C.glutamicum电击转化的影响43
3.3.2 细菌生长至不同时期对转化效率的影响43
3.3.3 电场强度对转化率的影响43-44
3.3.4 细胞浓度对转化效率的影响44-45
3.4 重组菌株的获得与基因鉴定45-46
3.5 SDS-PAGE检测46
3.6 相关产物检测46-50
3.6.1 赖氨酸的定性浅析46-47
3.6.2 赖氨酸的定量测定47
3.6.3 葡萄糖定量测定47-48
3.6.4 尸胺浅析48-50
3.7 基因工程菌发酵条件的探讨50-55
3.7.1 重组菌与原始菌生长曲线及重组菌的初始尸胺产量50-51
3.7.2 接种量对发酵的影响51-52
3.7.3 供氧条件对尸胺发酵的影响52-53
3.7.4 碳源、氮源、豆饼水解液对尸胺发酵的影响53-55
3.7.5 添加醋酸对发酵的影响55
3.8 优化条件下发酵55-57
3.9 酶活测定57-59
4 结论59-60
5 展望60-61
6 参考文献61-66
L,比优化前提升了83%。关键词：赖氨酸脱羧酶论文谷氨酸棒杆菌论文尸胺论文本论文由www.808so.com摘要4-5ABSTRACT5-91前言9-211.1尸胺介绍9-141.1.1尸胺的性质91.1.2尸胺的生物学作用9-111.1.3新型耐高温 WWw.808so.com 808论文查重
对于脱羧酶一步法生产尸胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌构建及发酵条件优化
更新时间：2024-04-15
作者：用户投稿
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